APG9 Terlokalisasi ke Kompartemen Perivakuolar
Dengan menggunakan gradien kepadatan sukrosa, sferoplas yang mengalami lisis osmotik difraksinasi dan puncak untuk Apg9p dan penanda membran vakuola Pep12p tidak bermigrasi bersama. Hal ini menunjukkan bahwa Apg9p terlokalisasi ke kompartemen perivakuolar yang berbeda.
Mikroskopi imunoelektron dari galur mutan apg9D mengonfirmasi pengamatan ini. Pelabelan dengan FM 4-64, pewarna styryl lipofilik, mengungkapkan keberadaan struktur bertitik yang disandingkan dengan membran vakuola.
Autofagi
Selama kondisi vegetatif yang kaya nutrisi, ragi Saccharomyces cerevisiae mengangkut protease residen, aminopeptidase I (API), ke vakuola melalui mesin penargetan sitoplasma ke vakuola (Cvt). Mesin ini juga mengisolasi sitosol massal ke dalam vesikel transpor membran ganda yang ditargetkan ke kompartemen autofagosom. Proses ini dipicu oleh kelaparan dan membutuhkan Atg1 dan Atg9.
Pada sel mamalia, mAtg9 berinteraksi dengan dTRAF2 (homolog TRAF6) untuk mengatur aktivitas kinase terminal-N c-Jun (JNK) sebagai respons terhadap stres oksidatif. Penipisan dTRAF2 atau mAtg9 membahayakan apoptosis yang diinduksi JNK, pembaruan epitel, dan induksi autofagi.
APG9 adalah protein terikat membran yang penting untuk pembentukan autofagosom. Ia berfungsi sebagai pengacak lipid untuk mendistribusikan fosfolipid yang datang melalui Atg2 dari kumpulan vesikel sitoplasma ke membran autofagosom yang sedang tumbuh. Ia juga mengendalikan perluasan membran autofagosom dan diperlukan untuk fusi vesikel dengan kompartemen endosom. Ia terlibat dalam degradasi komponen seluler selama autofagi dan merupakan pengatur autofagi dalam sel tumor.
Vesikel Cvt
Pada sel tipe liar, APG 9 mengikat kompartemen Cvt dan dikaitkan dengannya. Asosiasi membran ini dikonfirmasi dengan menggunakan prosedur ekstraksi deterjen di mana sel tipe liar diubah menjadi sferoplas dan dilisis secara osmotik dalam kondisi yang mengganggu membran plasma tetapi mempertahankan membran vakuola. Apg9p ditemukan diperkaya dalam fraksi pelet kecepatan rendah saat dilarutkan dengan 2% Triton X-100, dan tidak dapat dipisahkan dari pelet kecepatan tinggi dalam gradien densitas sukrosa.
Jalur Cvt adalah proses berbasis degradasi, tetapi juga mengirimkan muatan ke lumen vakuola. Proses pengangkutan secara morfologis mirip dengan autofagi nonselektif, dan bergantung pada mesin fusi vesikel, termasuk Q-SNARE Vam3 dan Vti1, protein docking Vps18, dan rab GTPase Ypt7.
Jalur Cvt juga memerlukan sitoskeleton aktin untuk mengikat kargo ke PAS. Hal ini didukung oleh pengamatan bahwa galur dengan aktin yang terganggu menunjukkan cacat dalam pembentukan vesikel Cvt tetapi tidak autofagi. Selain itu, kompleks pengikat aktin Arp2/3 diperlukan untuk lokalisasi prApe1 yang tepat ke PAS.
Kompartemen endosomal
Kompartemen vakuola autofagi dicirikan oleh pH intraluminalnya yang rendah, suatu sifat yang dimediasi oleh H+-ATPase yang sama yang mengasamkan sistem endomembran. Enzim ini, yang disebut ATPase vakuolar (V-ATPase), unik karena tidak memerlukan masuknya anion permean yang digabungkan untuk berfungsi. Kompleks ESCRT-III yang mengandung V-ATPase berperan dalam sitokinesis dan pembentukan tunas virus, tetapi juga diperlukan untuk mendukung invaginasi dan penjepitan membran endositosis untuk membentuk MVB. Proses ini penting untuk transportasi sitoplasma ke vakuola dan pembentukan vesikel autofagik alternatif selama kekurangan nutrisi.
Sel ragi yang mengekspresikan versi Apg9p yang ditandai mengalami kekurangan nitrogen. Protein rekombinan dideteksi oleh imunoblot dalam gradien sukrosa menggunakan penanda vakuola, alkali fosfatase (Pho8D60p). Protein ini bermigrasi bersama vesikel dari sistem endomembran, termasuk ER dan kompleks Golgi, tetapi tidak memasuki vakuola. Imunoblot membran vakuola yang dimurnikan mengonfirmasi temuan ini. APG9p terlokalisasi ke kompartemen berbeda dalam sistem endomembran yang tidak tumpang tindih dengan organel yang diketahui.